等電聚焦電泳色譜儀的載體兩性電解質(zhì)

等電聚焦電泳色譜儀是在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時，載體兩性電解質(zhì)形成一個由陽極到陰極逐步增加的pH梯度，不同的蛋白質(zhì)移動到其相當(dāng)?shù)牡入婞c位置上，聚焦于一個狹窄區(qū)帶中的過程。載體兩性電解質(zhì)是一系列脂肪族多氨基多羧酸同系物和異構(gòu)體組成的混合物，具有很多既不相同又十分接近的相互連接的pH值，pH = 3～10。

一、理想的載體兩性電解質(zhì)應(yīng)具備的特征：

1、分子量要小，易與被分離大分子物質(zhì)分離。

2、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

3、各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的緩沖能力。

4、在pI處具有足夠的電導(dǎo)，導(dǎo)電性均勻。

5、載體兩性電解質(zhì)的數(shù)目要足夠多。

6、可溶性好。

7、對280nm的紫外光沒有或僅有很低的吸光度，不干擾樣品的測定。

二、載體兩性電解質(zhì)pH梯度的形成：

載體兩性電解質(zhì)是一系列不同分子的兩性電解質(zhì)組成的混合物，通電后，它們將各自遷移到適當(dāng)位置而形成一個連續(xù)的pH梯度。

1、沒通電時的變化：

所有的載體兩性電解質(zhì)分子都荷電，只是溶液中荷正電和荷負(fù)電的基團數(shù)目相等，凈電荷為零。

2、引入電場時的變化：

載體兩性電解質(zhì)分子將向陰極或陽極遷移，帶有低pI的分子（荷多的負(fù)電）將快地向陽極遷移。當(dāng)它達(dá)到凈電荷是零的位置時才停止。一些低pI的載體兩性電解質(zhì)分子（荷其次多的負(fù)電）也將向陽極移動，直到它的凈電荷被減少到零時才停止。

在電解槽中，通電后正負(fù)兩極都發(fā)生電極反應(yīng)：

正極端反應(yīng)：6H2O → O2 + 4H3O+ + 4eˉ

負(fù)極端反應(yīng)：4H2O + 4eˉ→ 2H2 + 4OHˉ

在負(fù)極引起pH值升高，在正極引起pH下降，在電極槽的正極端放的是酸性溶液，負(fù)極端放的是堿性溶液，造成了在電極附近pH的急劇變化。由于載體兩性電解質(zhì)是一系列不同分子的兩性電解質(zhì)組成的混合物，設(shè)其中某一成分A的pI = pH′，當(dāng)環(huán)境中的pH＞pH′時，它帶負(fù)電荷，朝正極移動。當(dāng)環(huán)境pI＜pH′時，它帶正電荷，朝負(fù)極移動，直至移動到它的等點電處才停止。由于A在它的pI處具有一定的緩沖能力，在它附近形成一個pH穩(wěn)定區(qū)域。同樣，載體兩性電解質(zhì)中各種兩性電解質(zhì)也會各自遷移到它們的等電點處，由于它們的數(shù)量足夠多，各自的等電點相差很小，從而形成一個pH梯度。

假設(shè)在一個系統(tǒng)中含有極多有適當(dāng)?shù)牡入婞c和它的等電點處有一定緩沖能力的載體兩性電解質(zhì)，則形成的pH梯度是連續(xù)平滑的。

三、載體兩性電解質(zhì)pH梯度的選擇：

在測定未知蛋白質(zhì)時，可先采用pH = 3～10的載體兩性電解質(zhì)，經(jīng)初步測定后改用較窄的以提高分辨率。