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教你快速了解制備型液相色譜

制備型加壓液相色譜，按照色譜柱和樣品量的大小，分為：（1）低壓液相色譜；（2）中壓液相色譜；（3）高壓液相色譜；（4）快速色譜。低壓、中壓與高壓液相色譜的壓力范圍之間會(huì)存在一定交疊，沒有統(tǒng)一、明確的標(biāo)準(zhǔn)?！　?.快速色譜　　柱壓通常為2bar（或30psi）左右，對(duì)于那些容易分離的簡(jiǎn)單混合物，由于快速色譜具有操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，常常是實(shí)驗(yàn)室的首選。但快速色譜不同于一般的層析分離，這種分離沒有壓力，而快速分離通常使用瓶裝氮?dú)饧訅?，使流?dòng)相具有一定的流速，從而縮短了分離時(shí)間。　　快速色譜使用的柱子一般是玻璃柱，柱直徑為3～10cm．長(zhǎng)度為7～15cm?？焖偕V中使用最廣泛的固定相為硅膠。采用的粒徑通常為：25～40μm，40～63μm或63～200μm的球形固定相。其它如鍵合相、氧化鋁、聚酰胺吸附劑也常用作快速色譜的固定相使用?！　?.低壓色譜（LPLC）　　柱壓一般低于5bar（或75psi）?！　〉蛪荷V一般是由蠕動(dòng)泵、進(jìn)樣閥和檢測(cè)器組成，可以連續(xù)化，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)的梯度淋洗和餾分收集等操作。色譜柱管一般是玻璃或聚合物材料的，長(zhǎng)度一般為240-440mm，內(nèi)徑為10-40mm?！　?duì)于大多數(shù)在紫外區(qū)有吸收的物質(zhì)，光學(xué)檢測(cè)器很常用。填料一般使用軟質(zhì)的葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、合成高聚物或離子交換劑，粒徑一般為40-60μm?！　?.中壓液相色譜（MPLC）　　柱壓在5-20bar（或75-300psi）之間，廣泛用于實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模的生物制品(如動(dòng)物臟器提取液、濃縮液、體液、植物提取液、生物技術(shù)發(fā)酵液等--往往需要經(jīng)過濾膜作初級(jí)凈化)的處理，以提取或純化所需的產(chǎn)品?！　≈袎阂合嘀苽渖V的主要部件為輸液泵、進(jìn)樣閥、檢測(cè)器、餾分收集器等，早期的中壓液相制備色譜，其輸液泵最大流速可達(dá)156mL/min，并配有阻尼器，以保證液流的穩(wěn)定；進(jìn)樣器配有0.5-50mL的不同體積的定量管；檢測(cè)器有紫外和示差折光檢測(cè)器，流通池體積比較大，允許大流量流動(dòng)相通過而無需分流；餾分收集器有原盤式和排式兩種，原盤式的接收管最多達(dá)80個(gè)，而后者則更多；色譜柱內(nèi)徑9-105mm，長(zhǎng)度250-1760mm不等?！　?duì)于一般中壓制備色譜，當(dāng)色譜柱直徑較大時(shí)，柱頭往往設(shè)計(jì)成錐形或有類似于傘狀的液流導(dǎo)向結(jié)構(gòu)，使得當(dāng)大量樣品進(jìn)入到柱頭上時(shí)，能迅速地分散到整個(gè)柱橫截面上，及時(shí)被流動(dòng)相沖走，避免了因樣品的局部過濃而引起柱超負(fù)荷和譜帶加寬。柱子填料則采用比較耐壓的交聯(lián)改性的多糖凝膠(如Sepharose CL，Superose等)，聚合物微球，復(fù)合材料介質(zhì)或硬質(zhì)SiO2基體的化學(xué)鍵合相等，粒徑一般在25～40μm（最常用的填料尺寸是15-25μm，25-40μm或40-63μm），可采用濕法或干法裝柱?！　?.高壓液相色譜(HPLC)　　是指柱壓一般大于20bar（或300psi）的“高壓(或高效)液相色譜”，通常指所用色譜柱的塔板數(shù)大于2000，一般是在2，000～20，000的范圍之間。　　當(dāng)需要從大量的物質(zhì)中分離純化不足1％的所需成分時(shí)，分離工作將會(huì)十分困難，往往在純化的最后階段需要使用10μm或更小顆粒的高效填料。為獲得所需微量組分，可采用如下分離手段：制備型分離→半制備型分離→分析型分離→產(chǎn)物。為提高每次分離獲得純品的數(shù)量，制備型高壓液相色譜分離通常在超載情況下運(yùn)行?！　「邏阂合嗌V，即目前常用的高效液相色譜。色譜柱內(nèi)填裝的是粒度范圍較窄的微小顆粒固定相(3～30μm)，為使流動(dòng)相流出，需采用較高的壓力，同時(shí)系統(tǒng)的復(fù)雜性及成本亦增大，但分辨率可得到較大的提高。而填裝較大顆粒的固定相時(shí)，如中壓液相色譜系統(tǒng)，裝柱較容易，柱的通透性較高(只需較低的泵壓力)，可采用更大的色譜柱和更經(jīng)濟(jì)的儀器，由此分辨率也較低?！　?　　用分析型高壓液相色譜進(jìn)行制備型分離　　當(dāng)所需純化合物的量很少時(shí)(微克級(jí)至幾毫克)，可用分析型色譜柱進(jìn)行多次分離。效果和利用大直徑色譜柱進(jìn)行一次性分離相同。采用小直徑色譜柱時(shí)，可利用已有的分析型儀器，而無需在色譜柱、填料及附件方面投入更大資金；另外，還可在很大程度上避免由于放大所產(chǎn)生的問題，使分離速度加快?！　⌒≈睆缴V柱的尺寸一般為250×4.6mm，通常裝有反相填料，每次可進(jìn)樣5～100ug，通過多次進(jìn)樣分離，可獲得足夠的純品。例如，Suzuki等(1994)報(bào)道從豆科植物羽扇豆(Lupinus Hirsutus)中分離一羽扇豆生物堿糖苷時(shí)，其最后的分離步驟采用LiChrosorb Si60，5μm，250×4.6mm色譜柱進(jìn)行高壓液相色譜分離，洗脫劑為含25％甲醇的yi醚溶液－5％氨水50:1?！　〗?jīng)常需用分析型色譜柱進(jìn)行分離的一個(gè)領(lǐng)域是對(duì)肽類化合物的純化。生物活性肽的含量通常很低，用分析型高壓液相色譜作為最后的純化手段時(shí)，不會(huì)使色譜柱超載。　　為了提高分離效率，可將分析型高壓液相色譜柱連接起來使用。此時(shí)可采用顆粒度在20～30μm的填料，以保持適當(dāng)?shù)耐ㄍ感?，尤其是?dāng)使用含水溶劑時(shí)。當(dāng)使用己烷等有機(jī)溶劑時(shí)，由于流動(dòng)相的粘度較低，可使用顆粒度為10μm的填料?！　∪欢捎诜治鲂蜕V系統(tǒng)無法提供大規(guī)模制備型分離所需的流速，其應(yīng)用受到一定限制。

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