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使用分光光度計(jì)測定蔗糖含量

使用分光光度計(jì)測定蔗糖含量

酶是非常有用的助手，憑借其極高的專一性和重現(xiàn)性能夠檢測到所需的分子。正是因?yàn)橛写颂匦裕麄兛芍谱鞒蓹z測試劑盒，用來檢測果汁、紅酒、啤酒、雞蛋和肉類等各類食品的各種底物如糖和其它碳水化合物、酸和醇等。酶試劑盒受歡迎還因?yàn)樗腥缦聝?yōu)點(diǎn)：首先，和其它測試方法比起來它的樣品制備快速且簡單。其次，每次測試的成本非常低。最后，測試不需要任何危險(xiǎn)試劑。酶試劑盒的原理是基于輔酶系統(tǒng)煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD/NADH）的顏色變化進(jìn)行檢測 – 還原態(tài)(NADH)在340nm有光譜吸收。

我們通過檢測軟飲料中的蔗糖含量來舉例說明。第一步，蔗糖被酶分解成葡萄糖和果糖。然后通過己糖激酶將葡萄糖和果糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸。另外一種酶將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化成6-磷酸葡萄糖。在后一個(gè)反應(yīng)中，輔酶NAD被還原成NADH。NADH的生成可以通過測量340nm的吸收峰檢測到，它直接與樣品中的蔗糖含量成比例。然而，由于大部分樣品不僅含有蔗糖，也含有葡萄糖，而且葡萄糖也會代謝產(chǎn)生NADH，因此在計(jì)算中必須減去葡萄糖的量。

實(shí)驗(yàn)過程

進(jìn)行測試時(shí)，作為對照品的蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品和相應(yīng)的空白必須根據(jù)試劑盒制造商的要求在標(biāo)準(zhǔn)1cm石英比色皿中制備，如下表所示。在本例中我們采用的是Sigma-Aldrich公司的蔗糖試劑盒[1]。

比色皿

蔗糖分析試劑[mL]

樣品量[mL]

水[mL]

蔗糖分析試劑空白

0.1

-

0.1

葡萄糖分析試劑空白

-

-

0.2

對照品空白

-

0.1

0.1

對照品測試

0.1

0.1

-

樣品空白

-

0.1

0.1

樣品測試

0.1

0.1

-

將每個(gè)比色皿中物質(zhì)混合均勻并在室溫靜置10分鐘。然后將2.0 mL葡萄糖分析試劑加入到每個(gè)比色皿中，混合均勻并在室溫再靜置15分鐘。最后在梅特勒-托利多的UV5Bio上測量340nm的吸光度。如果連接了LabX軟件，儀器可以在一個(gè)方法中定義所有計(jì)算，這樣就可以自動(dòng)獲得最終結(jié)果，無需復(fù)雜的人工計(jì)算。如果儀器配備了CuvetteChanger自動(dòng)多聯(lián)池，可以一次加載所有的空白、對照品和樣品，使得測量流程變得更便利。

通過下面公式計(jì)算得到蔗糖濃度。首先計(jì)算總空白，它包括了樣品和試劑的吸光度：

A(總空白)=A(樣品/對照品空白)+A(蔗糖分析試劑空白)-A(葡萄糖分析試劑空白)

對于樣品和對照品，因生成NADH產(chǎn)生的吸光度差值可如下計(jì)算：

ΔA=A樣品/對照品測試-A總空白

現(xiàn)在就可以計(jì)算得到蔗糖濃度了：

（ε：蔗糖的吸光系數(shù)，d：光程）

總結(jié)

蔗糖含量可以很容易的使用酶試劑盒和紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行測量。酶分析強(qiáng)大之處在于高專一性和靈敏性，可以分辨蔗糖和其它糖分子如葡萄糖和果糖。酶分析可以廣泛用于飲料和其它食品。

使用配置了自動(dòng)多聯(lián)池和LabX軟件的UV5Bio超越系列分光光度計(jì)，可以大大加快測量流程。此外，復(fù)雜的計(jì)算過程可以在測量結(jié)束后即刻自動(dòng)完成并安全的保存在LabX數(shù)據(jù)庫中，日后可用于梅特勒-托利多其它分析儀器測量的進(jìn)一步計(jì)算。

參考資料

[1] Sigma-Aldrich: 蔗糖試劑盒（貨號SCA20）

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